Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения бпк 5


Глава 1. Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения БПК



страница3/6
Дата09.01.2018
Размер0.54 Mb.
Название файлафх. курсач.docx
ТипРеферат
1   2   3   4   5   6

Глава 1. Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения БПК

1.1. Взаимодействие ферментных систем дрожжевых клеток

Оценивая состояние окружающей среды, очень часто важно выявить не столько специфический ксенобиотик, сколько весь путь загрязнителей, то есть провести оценку сложных показателей состояния окружающей среды, например, потребность в кислороде в биохимическом состоянии (БПК), ведь именно это является важным показателем, используемый для мониторинга органического загрязнения поверхности подземных, грунтовый и сточных вод. Стандартный способ выявления БПК является достаточно сложным и трудоёмким и может занимать до 5 дней. Одновременно с тем применение биосенсорного даёт возможность сократить время анализа от 5 дней до 1 часа или меньше. Биоматериал, который используется в рецепторном элементе биосенсора БПК, должен иметь широкую субстратную специфичность, характерную для целых клеток микроорганизмов. В большинстве случаев при разработке внутриклеточных биосенсоров в рецепторных элементах применяют бактерии. В таком способе описаны медиаторные биосенсоры для определения БПК на основе Pseudomonas fluorescens [1], Escherichia coli [2], Proteus vulgaris [3].

Дрожжи Debaryomyces hansenii были использованы как биокатализатор в биосенсорах на основе кислородного электрода для дальнейших исследований. Перспективы использования этого микроорганизма в биосенсорах показаны благодаря широкой специфичности субстрата и стабильности хранения.

Для создания биосенсора, измерения которых не зависят от содержания кислорода среды, используются медиаторы переноса электронов из ферментных систем клеток к электродам.

Рабочий электрод был образован из пластиковой трубки, наполненной пастой "Графит порошок минеральное масло-посредник" (в случае иммобилизованного медиатора) ". Пластиковая трубка содержит серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. В растворимый медиатор добавляли буферный раствор, в котором проводили измерения.

Микроорганизмы D. hansenii иммобилизуются следующим образом: 3 мкл клеточной суспензии (200 мг / мл) наносят на поверхность пасты, наполняют шприц, и сушат при комнатной температуре в течение 15 минут. Мембрана-диализа присоединена к поверхности электродов с помощью пластикового кольца.

Ответы биосенсоры были записаны с помощью двухэлектродной схемы. Рабочим электродом был угольно-пастовых электрод (площадь поверхности 6.3 мм2) с иммобилизованными дрожжевыми клетками D. hansenii, эталонным электродом был насыщен хлорид серебра. Измерения проводили в фосфатном буферном растворе с рН 6,8 при постоянном потенциале 400 мВ, объемом клетки 4 мл. Измерения проводили при непрерывном перемешивании раствора в электролитической клетке с помощью магнитной мешалки (300 об / мин). После установления постоянного уровня тока в клетке, микропипеткой вводят количество 1М или 0,1 М раствора субстрата, необходимую для получения заданной концентрации. После каждого измерения ячейку промывают (3-4 мл буферного раствора).

Измеренный параметр сигнала датчика был амплитудой изменения интенсивности тока, которая определяется как разница между конечными и начальными значениями токов: до и после введения субстрата в измерительную ячейку.

D. hansenii с медиаторами электронного транспорта. Выбор эффективного медиатора переноса электрона с ферментных систем микроорганизмов на электрод является одной из важных задач при разработке биосенсора. Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяются наличием ферментных систем для этих соединений и зависит как от природы клеток, так и от структуры и свойств медиатора. Использование соединений различной структуры и свойств: гексацианоферрат (III) калия (ХКФ), хиноны различных структур, ферроцен и его производные, 2,6-дихлорфенолиндофенола т.д. были описаны как медиатор в биосенсорах на основе бактериальных клеток [1, 5, 6].

Следует отметить, что дрожжи D. hansenii относятся к эукариотам и имеют более сложную структуру, чем бактериальные клетки. Кроме того, ферментные системы окисления углеводов и спиртов в клетках дрожжей локализуются внутри клетки (в цитоплазме или органеллах), что, вероятно, затрудняет их взаимодействие с медиаторами переноса электронов. Поэтому актуальной задачей является изучение взаимодействия с медиаторами эукариотических клеток - дрожжей D. hansenii.

Медиаторы в биосенсорах условно можно разделить на две группы: водорастворимые медиаторы, которые добавляются непосредственно к буферному раствору и нерастворимые (или плохо растворимые) в медиаторы водной среды, которые иммобилизуются на электрод (часто такой посредник смешивается в графит паста, из которой образуется электрод).

В литературе описано применение системы из двух медиаторов в биосенсоре на основе целых дрожжевых клеток Saccaromyces cerevisiae [7]. Показано, что при использовании системы из двух медиаторов — 2-метил-1,4-нафтохинона (малорастворимый иммобилизованный медиатор) и ГЦФ (растворимый медиатор) наблюдается повышение генерируемого сенсором тока при добавлении медиаторов и субстрата. Было выдвинуто предположение, что 2-метил-1,4-нафтохинон (МНХ), как липофильное соединение, способен проникать через липидную мембрану внутрь клетки, взаимодействовать с восстановленной формой фермента, забирать от нее электроны и, проникая через оболочку клетки, передавать их из клетки на второй (водорастворимый) медиатор — ГЦФ, который передает электроны на электрод (рис. 1).


Рисунок 1.1. Схематическая модель окисления субстрата клетками дрожжей с использованием двухмедиаторной системы иммобилизованный медиатор (M/MH2) — растворимый медиатор ГЦФ ([Fe(CN)6]3−/[Fe(CN)6]4−), S — субстрат



Рисунок 1.2. Типичные ответы сенсора на основе дрожжей D. hansenii и двухмедиторной системы: первый медиатор — растворимый ГЦФ (концентрация в буферном растворе 10 мМ, добавляется в момент времени 0 сек); второй медиатор — иммобилизованный (1 — 1,4-НХ, 2 — ФЦ, 3 — ДБХ, 4 — МБХ, концентрация в графитовой пасте 10%). Субстрат (глюкоза 25 мМ) вводится в кювету в 200 сек от начала измерения


Подобная двухмедиаторная система была применена при разработке биосенсора на основе дрожжей D. hansenii. В качестве водорастворимого медиатора использовался ГЦФ, а в качестве второго медиатора, который добавлялся в графитовую пасту, использованы малорастворимые хиноны различного строения: 1,4-нафтохинон (1,4-НХ), 1,2-нафтохинон (1,2-НХ), 2,5-дибром-1,4-дибромхинон (ДБХ), 2-метил-1,4-хинон (МХ) и ферроцен (ФЦ). Полученные данные представлены на рис. 1.2 и суммированы в таблице 1.1.
Таблица 1.1. Ответы биосенсоров на основе дрожжей D. hansenii на глюкозу при использовании двухмедиаторной системы ГЦФ — иммобилизованный медиатор

Растворимый медиатор

Иммобилизованный медиатор

Ответ сенсора, нА

Гексацианоферрат

(III) калия K3[Fe(CN)6]


1,4-нафтохинон

1900 ± 100

1,2-нафтохинон

0

2,5-дибром-1,4- дибромхинон

230 ± 70

2-метил-1,4-хинон

90 ± 50

ферроцен

280 ± 80

Из данных, представленных в таблице 1.1 следует, что наибольший ток сенсор на основе дрожжевых клеток D. hansenii генерирует при использовании двухмедиаторной системы ГЦФ — 1,4-НХ. Если принять гипотезу, что хиноны проникают через мембраны дрожжей внутрь клетки и затем взаимодействуют с восстановленной формой фермента, то из полученных данных можно сделать вывод, что 1,4-НХ легче проникает сквозь мембрану, что, скорее всего, связанно с его большей гидрофобностью по сравнению с другими использованными хинонами.

При использовании системы медиаторов ГЦФ — 1,2-НХ не наблюдалось роста тока сенсора при введении субстрата, свидетельствующего о протекании биоэлектрокаталитического процесса. Это указывает на то, что 1,2-НХ не способен взаимодействовать с ферментами, катализирующими окисление глюкозы в дрожжах D. hansenii и не может служить переносчиком электронов от биомолекул на электрод в биосенсорах на основе этих дрожжей. Неспособность 1,2-НХ служить переносчиком электронов в системах с интактными клетками объясняется отличием его структуры от убихинона — компонента цепи переноса электронов, который является 1,4-хиноном.

Из данных, представленных на рис. 1.3 следует, что сенсор на основе дрожжей D. hansenii с использованием двух медиаторов генерирует более высокие токи по сравнению с сенсорами, которые использовались с одним медиатором.



Рисунок 1.3. Типичный ответ сенсора на основе целых дрожжевых клеток D. hansenii: 1 — графитовая паста без медиатора, ГЦФ 10 мМ; 2 — графитовая паста с 15% 1,4-НХ; 3 — графитовая паста с 15% 1,4-НХ, ГЦФ 10 мМ. 1,4-НХ вмешан в графитовую пасту, ГЦФ добавляется в буферный раствор в момент времени 0 с, субстрат — глюкоза (12,5 мМ) вводится в буферный раствор через 200 с от начала измерения


Ответ сенсора на основе двухмедиаторной системы почти в 10 раз выше, чем суммарный ответ одномедиаторных систем на основе ГЦФ или на основе 1,4- НХ, что свидетельствует, об эффективности применения двухмедиаторной системы в сочетании с целыми клетками D. hansenii.

Таким образом, для дальнейшей работы была выбрана система на основе дрожжей D. hansenii в сочетании с двухмедиаторной системой ГЦФ — 1,4- НХ.



1.2. Рабочие параметры медиаторного биосенсора на основе дрожжей D. Hansenii

При разработке биосенсоров важным этапом является определение рабочих параметров. Величина тока, генерируемого биосенсором в присутствии определяемого вещества, может изменяться в зависимости от условий (pH, концентрация медиатора), в которых проводятся измерения.



При исследовании зависимости величины сигналов биосенсора на основе дрожжей D. hansenii от рН среды использовали фосфатный буферный раствор с различными значениями рН в диапазоне от 5,4 до 8,0. Для биосенсора на основе целых дрожжевых клеток D. hansenii максимальный сигнал получен при рН=6,8. (рис1.4).

Рисунок 1.4. Зависимость величины ответа сенсора на глюкозу (25 мМ) от рН среды для биосенсора на основе дрожжей D. hansenii и двухмедиаторной системы (ГЦФ и 1,4-нафтохинон)

Были получены зависимости ответа сенсора от концентрации медиаторов при постоянной концентрации глюкозы.

Из графиков зависимости ответа сенсора от концентрации медиатора видно, что при увеличении концентрации медиаторов (ГЦФ до 10 мМ и 1,4-НХ до 15 %) ответы биосенсора возрастают, что является типичным для ферментативных реакций. Высокие концентрации каждого медиатора уменьшают ответ сенсора на субстрат (рис. 1.5-а,б). В случае с 1,4-НХ это может быть связано с ингибированием медиатором ферментных систем клеток, т.к. предполагается, что нафтохинон проникает непосредственно внутрь клетки.


Рисунок 1.5. Зависимость ответов сенсора на основе D. hansenii на глюкозу (12,5 мМ): а) — от концентрации ГЦФ (при постоянном содержании в пасте 1,4-нафтохинона — 10%) и б) — концентрации 1,4-нафтохинона (при постоянном содержании ГЦФ в буферном растворе — 10 мМ)


Таким образом, максимальный ответ сенсора на основе дрожжей D. hansenii достигается при концентрациях ГЦФ в кювете 10 мМ и 1,4- нафтохинона в графитовой пасте 15%.

Важным параметром для практического применения биосенсоров являются операционная и долговременная стабильность. Операционная стабильность для биосенсоров на основе целых клеток D. hansenii измерялась в течение дня при концентрации глюкозы 12,5 мМ (рис.1.6-а). Стандартное отклонение для 15 измерений составило 4%.



Рисунок 1.6. Операционная (а) и долговременная (б) стабильность биосенсора на основе целых дрожжевых клеток D. hansenii. Концентрация глюкозы 12,5 мМ, ГЦФ 10мМ, содержание в пасте 15% 1,4-нафтохинона


Была изучена долговременная стабильность биосенсора на основе D. hansenii. Из полученных данных (рис. 1.6-б) можно сделать вывод, что ответ сенсора за 15 суток падает до нуля, что может быть связано не только с гибелью микроорганизмов, но так же с вымыванием 1,4-НХ из графитовой пасты.

Для применения медиаторных биосенсоров в анализе реальных растворов большое значение имеет субстратная специфичность. Была изучена субстратная специфичность биорецепторного элемента на основе дрожжей D. hansenii. Результаты представлены на рис. 1.7



Рисунок 1.7. Субстратная специфичность биорецепторного элемента на основе D. hansenii (за 100% принят ответ сенсора на глюкозу). Концентрация 1,4-НХ 15%, ГЦФ 10 мМ, субстрата 25 мМ


Из представленного графика видно, что биосенсор, основанный на дрожжах D. hansenii и двухмедиаторной системе даёт высокие ответы на моносахариды и спирты нормального строения. Стоит так же заметить, что биосенсор основанный на дрожжевых клетках D. hansenii, даёт ответ на глюкозу, фруктозу, этанол и глицерин, которые могут присутствовать в реальных образцах сточных вод пищевых производств, но не дает ответ на глутамат, который входит в состав стандарта для определения БПК (глюкозо-глутаматная смесь).

1.3. Определение БПК микробным медиаторным биосенсором на основе дрожжей D. hansenii

Для создания макета микробного биосенсора для определения БПК использована двухмедиаторная система (ГЦФ — 1,4-НХ) в сочетании с дрожжевыми клетками D. hansenii. В качестве модельной смеси для определения зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата использована смесь, содержащая равные массы глюкозы и глутаминовой кислоты (ГГС). Применение ГГС в качестве стандарта при анализе БПК определено в нормативных документах [8]. Из теоретического соотношения БПК5 = 0, 68 С [8], где С — концентрация ГГС (мг/л), проведен пересчет концентрации ГГС в значения БПК5. Линейный участок градуировочной зависимости ответов микробных биосенсоров от индекса БПК анализируемого раствора представлен на рис. 1.8.



Рисунок 1.8. Зависимость величины ответов биосенсора на основе D. hansenii и двухмедиаторной системы (ГЦФ — 1,4-нафтохинон) от значений индекса БПК5


По полученным данным были рассчитаны аналитические характеристики: диапазон определяемых концентраций 375-1400 мг O2/л, коэффициент чувствительности 0, 40 0, 01 нА л/мг O2.

В качестве образца для определения индекса БПК5 с помощью медиаторного биосенсора использована полученная в лабораторных условиях бродильная смесь на основе пшеничной муки, имитирующая состав сточных вод бродильных производств с известным значением БПК5, определенным стандартным методом (табл. 1.2).
Таблица 1.2. Значения индексов БПК5 бродильной смеси на основе пшеничной муки после процесса брожения, полученные с помощью медиаторного биосенсора и стандартным методом разбавления

Значение БПК5, определенное стандартным методом, г O2

Значение БПК5, определенное с помощью биосенсора на основе D. hansenii, г O2

49 ± 5

45 ± 4


Полученные результаты определения индекса БПК5 в образцах с помощью биосенсора согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления.

Таким образом, разработанный макет медиаторного биосенсора на основе дрожжей D. hansenii можно использовать для определения индекса БПК стоков бродильных производств, предприятий пищевой и биотехнологической промышленности, содержащих углеводы и спирты.




Глава 2. Сравнение эффективности медиаторов как акцепторов электронов для клеток d. hansenii при окислении глюкозы

2.1. Процесс взаимодействия медиатора с дрожжевыми

В качестве биорецепторных элементов медиаторных биосенсоров часто используют прокариотические клетки [1-3]. Это связано с мембранной локализацией ферментативных систем, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта [4]. Дрожжевые клетки применяют сравнительно редко [5]. Одна из причин редкого использования дрожжей в составе биосенсора, по-видимому, связана с тем, что медиаторный перенос электронов от эукариотических клеток на электрод затруднён [5]. Однако, в отличие от бактерий, дрожжи способны окислять более широкий спектр органических соединений и устойчивы к действию различных токсикантов и негативных факторов окружающей среды [6]. При этом дрожжи, например, D. hansenii характеризуются широким спектром окисляемых субстратов и стабильностью ферментативных систем в стрессовых условиях, что делают данные микроорганизмы перспективными биокатализаторами в биотехнологии.



Для выявления общих закономерностей эффективности переноса заряда на рабочую поверхность угольно-пастовых электродов необходимо установить, какие медиаторы можно использовать в таких системах. В качестве медиаторов использовались такие соединения как нейтральный красный, метиленовый синий, тионин, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексацианоферрат (III) калия. Для оценки эффективности медиаторов электронного транспорта, процесс формирования ответа биосенсора в результате окисления клетками дрожжей определяемых веществ в пробе рассматривали в рамках модели двухсубстратной ферментативной реакция, протекающая по механизму «пинг-понг» [7]. Согласно данной модели процессы, протекающие на электроде, можно описать уравнениями (1-2).

(1)

(2)

где S и P – субстрат и продукт; Moк и Mв – окисленная и восстановленная форма электронного акцептора внутри бактериальной клетки соответственно;

Eи Eв – фермент клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно;

k1, k-1, k2, k3, k-3 и k4 представляют константы скоростей соответствующих стадий реакции.



Общее уравнение скорости двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг» можно записать в виде:

(3)

где [S] и [M] – концентрация субстрата и медиатора соответственно;

[E] – концентрация ферментного комплекса in vivo;

kкат – каталитическая константа реакции;



KS и KM – константы Михаэлиса для субстрата и медиатора, соответственно.
Последние три константы связаны с константами скоростей в уравнениях (1) и (2) следующими соотношениями:





При иммобилизации микроорганизмов на электроде в амперометрическом режиме можно оценить скорость электрокаталитического окисления глюкозы дрожжевыми клетками из зависимости изменения стационарного тока при введении окисляемого субстрата от времени (где I - сила тока, t - время). Протекающий в системе ток пропорционален скорости реакции, а выражение (3) запишется в виде:



(4)

где (5)

Из уравнения (5) следует, что процесс электрокаталитического окисления субстратов дрожжами в присутствии медиаторов переноса электронов можно охарактеризовать тремя параметрами – максимальным током биоэлектрокаталитического окисления Imax, и константами Михаэлиса по KS субстрату и медиатору KM.

При условии избытка медиатора или субстрата уравнение (4) можно упростить и получить уравнения типа Михаэлиса-Ментен:





(6)



(7)

Путем обработки полученных экспериментально зависимостей генерируемого тока I при варьировании концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора и концентрации медиатора в условиях избытка глюкозы по уравнениям (6) и (7) можно вычислить значения KS и KM.

Сложность работы с дрожжами D. hansenii заключалась в том, что из всех исследуемых медиаторов электронного транспорта зарегистрировать окисление глюкозы удалось только в присутствии медиатора нейтрального красного, ранее было показана возможность использования медиатора ферроцена совместно с дрожжами D. hansenii в биоэлектрокатализе [8]. Поэтому эффективность использования нейтрального красного как медиатора электронного транспорта сравнивалась относительно ферроцена в рамках модели «пинг-понг» (рис.2.1).



А


Б


1 – ферроцен, 2 – нейтральный красный

Рисунок 2.1. Гипербоидальные зависимости ответа сенсора (или скорости ферментативной реакции окисления глюкозы) от концентрации: А медиатора (при избытке окисляемого субстрата), Б глюкозы (при избытке медиатора).


Оценку эффективности двух медиаторов, способных взаимодействовать с дрожжами D. hansenii проводили по величине отношения Imax/KM. Ферроцен как медиатор обладал более высоким значением параметра Imax/KM, а следовательно биосенсор на его основе способен генерировать больший аналитический сигнал при использовании меньших количеств медиатора.

2.2. Специфика использования дрожжевых клеток в медиаторном биоэлектрокатализе при окиси глюкозы

Проблема использования дрожжевых клеток в медиаторном биоэлектрокатализе связана со строением эукариот - ферментные системы зачастую локализованы внутри микроорганизма (в цитоплазме или органеллах), что затрудняет взаимодействие с медиаторами переноса электронов. Например, В статье [5] показано, что для дрожжей рода Candida из десяти медиаторов перенос электронов был могут осуществлять только гексацианноферрат (III) калия и гидроксиферроцен.



Одним из подходов к решению проблемы низкой эффективности медиаторов как акцепторов дрожжевых клеток является использование двухмедиаторных систем [9, 10]. В данной работе для увеличения эффективности переноса электронов от эукариотических клеток в исследуемую систему вводили второй медиатор – ферроцен.

Было выдвинуто предположение, что тионин, нейтральный красный, метиленовый синий, 2,6-дихлорфенолиндофенол как липофильные соединения способны проникать через липидную мембрану внутрь клетки, взаимодействовать с восстановленной формой фермента, забирать электроны и передавать их на иммобилизованный медиатор, который переносит электроны на электрод (рис. 2.2.).

Рисунок 2.3. Перенос электронов в двухмедиаторной системе


Эффективность растворимых медиаторов в биоэлектрокатализе в присутствие медиатора ферроцена рассматривалась также в рамках модели «пинг-понг». Для каждого медиатора были получены градуировочные зависимости при условии избытка субстрата и избытка медиатора (рис. 2.3., табл.2.1).

А


Б


1 – тионин, 2 - гексацианоферрат (III) калия, 3 - метиленовый синий, 4 - 2,6-дихлорфенолиндофенол, 5 – нейтральный красный.

Рисунок 2.3. Гипербоидальные зависимости ответа сенсора (или скорости ферментативной реакции окисления глюкозы) от концентрации: А медиатора (при избытке оксиляемого субстрата), Б глюкозы (при избытке медиатора).


Таблица 2.1. Параметры электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными дрожжами D. hansenii в присутствии медиаторов переноса электронов

Медитор

Избыток субстрата

Избыток медиатора

Imax, мкА

Km, мкМ

Imax/Km, мкА/мкМ

Imax, мкА

Ks, мкМ

Imax/Ks, мкА/мкМ

Нейтральный красный*

0,064±0,005

75±9

0,001

0,069±

0,009


100±20

0,001

Ферроцен

0,57±0,02

52±7

0,011

0,37±

0,04


90±10

0,004

Тионин**

1,6±0,1

11,4±0,2

0,15

0,95±0,05

7,9±0,2

0,12

Гексацианоферрат (III) калия

0,68±0,05

4,5±0,7

0,15

0,66±0,06

8,7±0,7

0,06

Метиленовый синий

0,34±0,02

1,0±0,2

0,34

0,42±0,06

7,0±0,8

0,06

2,6-Дихлорфенолиндофенол

0,29±0,04

4,3±0,4

0,07

0,39±0,02

9,1±0,4

0,04

Нейтральный красный

0,29±0,01

2,7±0,3

0,11

0,21±0,07

7,6±0,1

0,03

* В одномедиаторной системе

** В двухмедиаторной системе


В рамках модели «пинг-понг» отношение Imax/Ks характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом, соответственно, для ферментативного биоэлектрокатализа не зависимость данного отношения от природы медиатора указывало на пригодность выбранной модели для сравнения эффективности медиаторного биоэлектрокатализа. Ранее было показано, что для медитаров фенозинового ряда отношение Imax/Ks также различалось для бактерий G. oxydans [11], что связано с недостаточной устойчивостью феназиновых производных в растворе. Кроме того, при бимолекулярном взаимодействии фермента с субстратом высокая концентрация медиатора может ингибировать данный процесс, снижая параметр Imax/Ks.

Отношение Imax/KM может использоваться для оценки эффективности медиаторов в двухмедиаторной системе, так как учитывается и максимальный ответ биосенсора, который можно получить с использованием определенного растворимого медиатора, и количество медиатора, которое для этого необходимо применять. Чем выше значение Imax/KM, тем больший аналитический сигнал способен генерировать биосенсор при использовании меньших количеств медиатора.

Из анализа величин Imax/KM (таблицы 2.1) можно заключить, что эффективность растворимых медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду 2,6-дихлорфенолиндофенол < нейтральный красный < тионин ≈ гексацианоферрат (III) калия < метиленовый синий. Следует также отметить, что при использовании двухмедиаторных систем параметр Imax/KM увеличивается на порядок, что указывает на увеличение эффективности переноса электронов в присутствие второго медиатора. Вероятно, растворимый медиатор быстро восстанавливался клетками D. hansenii, а нерастворимый подвергался быстрому электрохимическому окислению [9]. Возможность использования ферроцена совместно с растворимыми медиаторами, которые функционируют только в двухмедиаторной системе, подтверждает предположенную схему.

2.3. Особенности контроля медиатора с естественным акцептором электронов кислородом

В медиаторном биоэлектрокатализе ключевым является вопрос, конкурирует ли медиатор с естественным акцептором электронов кислородом. Для ответа на данный вопрос находили относительные скорости восстановления 50 мкмоль/дм3 медиаторов в отсутствии кислорода и относительную скорость восстановления кислорода в отсутствие медиатора [11], т.е. сколько мкмоль медиатора или кислорода в единицу времени восстанавливает 1 г биоматериала. В нашем исследовании также были найдены начальные скорости восстановления 50 мкмоль/дм3 медиаторов используемыми клетками микроорганизмов, полученные результаты приведены в табл. 2.2.


Таблица 2.2. Начальная скорость восстановления 50 мкмоль/дм3 медиаторов различными микроорганизмами, мкмоль×г-1×с-1 (субстрат – глюкоза)

Микроорганизмы

Медиатор

Скорость, мкмоль×г-1 ×с-1

Ссылка



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©coolnew.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница
Контрольная работа
Курсовая работа
Теоретические основы
Лабораторная работа
Методические указания
Общая характеристика
Рабочая программа
Теоретические аспекты
Пояснительная записка
Практическая работа
Дипломная работа
Методические рекомендации
Федеральное государственное
История развития
Общие сведения
Учебное пособие
Основная часть
государственное бюджетное
Направление подготовки
Теоретическая часть
Физическая культура
Самостоятельная работа
История возникновения
Методическая разработка
Краткая характеристика
Практическое задание
квалификационная работа
Выпускная квалификационная
Гражданское право
Название дисциплины
бюджетное учреждение
государственное образовательное
образовательное бюджетное
Российская академия
Общие положения
теоретические основы
прохождении учебной
история возникновения
образовательная организация
Общая часть
Понятие сущность
Уголовное право
Современное состояние
Правовое регулирование
Финансовое право
Фамилия студента
Техническое задание
Методическое пособие
Финансовое планирование
Теория государства
Российская федерация