Мембранные белки: характеристика и структурные принципы Структура мембранных белков



Скачать 344.57 Kb.
страница3/9
Дата28.11.2018
Размер344.57 Kb.
Название файлаbestreferat-139282.docx
1   2   3   4   5   6   7   8   9
2.1. ДЕТЕРГЕНТЫ
В течение последних двух десятилетий появилось очень много детергентов, пригодных для очистки интегральных мембранных белков. В принципе нужно пытаться найти такой детергент, который не нарушал бы вторичную и третичную структуры мембранных белков, а лишь замещал бы большинство или все мембранные липиды, контактирующие с гидрофобными участками белковой молекулы. Конечной целью солюбилизации является встраивание белка в детергентиую мицеллу; последующая стратегия очистки состоит в разделении таких белково-детергентных комплексов.

Первая проблема — это подбор оптимальных условий солюбили-зации изучаемого белка. Детергенты, денатурирующие белки, не подходят для решения такой деликатной задачи. С другой стороны, многие детергенты недостаточно эффективно разрушают мембраны и образуют белоксодержащие смешанные мицеллы. Такие детергенты могут быть либо слишком гидрофобными, либо слишком гидрофильными для эффективного смешивания с мембранными липидами и — при достаточно высокой их концентрации — для превращения бислоя в глобулярные смешанные мицеллы. Сначала надеялись, что выбор необходимого детергента удастся систематизировать с помощью одного параметра, называемого гидро-фильно-липофильным балансом. Этот параметр, изменяющийся от 1 до 20, используется при получении сурфактантов в качестве меры относительной гидрофобности. Действительно, получены некие корреляции, из которых следует, что значение ГЛБ детергента может использоваться для предсказания его поведения в биологических системах. Вообще говоря, можно сказать, что детергенты со значением ГЛБ в диапазоне от 12,5 до 14,5 являются наиболее эффективными растворителями интегральных мембранных белков. Однако впоследствии выяснилось, что поиск оптимальных детергентов для определенного мембранного белка требует учета многих факторов и всегда должен сопровождаться эмпирической проверкой. Необходимо учитывать следующее.



  1. Максимальная солюбилизация исследуемого белка. Критерием является переход белка в супернатант после центрифугирования, при котором происходит осаждение мембраны.

  2. Солюбилизация белка в нужной форме. Обычно речь идет о сохранении его ферментативной активности, но иногда используются определенные спектральные характеристики или наличие конкретных белковых ассоциатов. Кроме того, необходимым условием является стабильность белка после солюбилизации. В некоторых случаях для поддержания биохимической активности вместе с детергентом добавляют экзогенные фосфолипиды. В качестве примера можно привести получение лактозопермеазы Е. coli и белка натриевого канала. Иногда для стабилизации белка после солюбилизации добавляют глицерол или другой полиол. Имеет смысл использовать также ингибиторы протеаз и проводить солюбилизацию в условиях, сводящих к минимуму вероятность их протеолитического расщепления.

  3. Возможность использования детергента в данной методике. Необходимо прежде всего учитывать заряд детергента, поведение при данном значении рН, ККМ и размер мицелл детергента. Последние свойства особенно важны. Детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, не удаляются при диализе или ультрафильтрации из-за слишком низкой концентрации мономеров детергента. С практической точки зрения это означает, что если концентрировать белок с помощью ультрафильтрации, то будет возрастать и концентрация детергента с низкой ККМ, а это может привести к денатурации белка. По этой причине многие исследователи предпочитают использовать детергенты с высокими ККМ, например октилглюкозид, соли желчных кислот или более современные цвиттерионные детергенты. Весьма ценными являются полистиреновые смолы, такие, как биобидз SM-2. Они избирательно связываются с детергентами типа тритон Х-100, удаляют их из раствора и позволяют обойтись вообще без диализа. Еще один фактор, который необходимо учитывать, — это поглощение света детергентом. Некоторые детергенты, например тритон Х-100, поглощают в ближней УФ-области, что делает невозможным определение концентрации белка по измерению оптической плотности при длине волны 280 нм.

С учетом всех этих факторов становится понятно, почему во многих случаях при выделении интегральных мембранных белков приходится использовать разные детергенты. Например, для солюбилизации можно применять тритон Х-100, а разделение с помощью ДЭАЭ-целлюлозы лучше проводить в присутствии октилглюкозида. Детергенты можно менять на стадии хроматографии, во время центрифугирования в градиенте плотности, а в некоторых случаях — с помощью диализа. Следует иметь в виду, что детергент, непригодный для солюбилизации определенного белка, может быть очень эффективным для сохранения белка в растворе после замены детергента. Очистку почти всегда следует проводить при избытке детергента в растворе, в противном случае равновесие будет сдвинуто в сторону агрегации мембранных белков, а не в сторону образования белково-детергентных комплексов. В некоторых случаях подобная агрегация может быть даже желательна, и последняя стадия очистки может состоять в удалении детергента. Но, как правило, при недостатке детергента происходят необратимое осаждение и потеря белка.

Необходимость поддержания концентрации детергента на определенном уровне создает дополнительнее трудности помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков; о некоторых из них мы уже говорили. Проблемы возникают и при использовании стандартного метода высаливания при высокой концентрации сульфата аммония: во многих случаях белок осаждается в комплексе с детергентом и липидом. Поскольку солевой раствор имеет высокую плотность, а детергент в агрегате — относительно низкую, то при центрифугировании преципитат будет оставаться на поверхности. Важно помнить, что очистке подвергаются белково-детергентные комплексы, нередко со значительным количеством связанного фосфолипида. Это сказывается на качестве разделения при хроматографировании, а также на результатах характеристики конечного прорастворимых белков, нужно определить число и молекулярную массу полипептидных субъединиц, их стехиометрию, размер и, возможно, форму молекулы, а также, если это необходимо, биохимическую активность.




Детергент 1

В табл. 1 и 2 перечислены наиболее широко используемые детергенты и указаны их свойства, важные для обсуждаемых нами вопросов. Эмпирически наиболее эффективными являются: 1) неионные детергенты (тритон Х-100, октилглюкозид); 2) соли желчных кислот (холат, дезоксихолат); 3) цвиттерионные детергенты (CHAPS, цвнттергент). Но выбор детергента, наиболее приемлемого для солюбилизации и очистки определенного мембранного фермента, по-прежнему осуществляется методом проб и ошибок.

ККМ, мМ

Мол.масса

1 Размер А мнцеллы

.грегационис число

х Удельный объем, мл/г

Ссылки

Долецилсульфат

1,33

288

24 500

85

0,864




натрия



















Холат натрия "

3

408

2100

5

0,778

(612, 1383]

Дезоксихолат

0,91

392

23 000

55

0,771




натрия "






















0,11

538

68 000

12

0,973




Тритои Х-100 2)

0,24

628

90 000

140

0,908




Твин 80 2)

0,012

1300

76 000

60

0,8%




Лаурилдиметил-

2,2

229

17 000

75

1,112

|612]

аминоксид



















^-D-Октил-

25

293

8000

27

0,820

[1242, 1213

глюкозид
















612]

^-D-Лаурил-

0,16

510

50 000

98

0,820




мальтозид



















CHAPS

8

615

6150

10

0,802




Цвиттергеит

3,6

335





0,957








Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9


База данных защищена авторским правом ©coolnew.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница
Контрольная работа
Курсовая работа
Теоретические основы
Общая характеристика
Лабораторная работа
Теоретические аспекты
Методические указания
Дипломная работа
Федеральное государственное
Пояснительная записка
Рабочая программа
Методические рекомендации
Основная часть
История развития
Общие сведения
Практическая работа
государственное бюджетное
Теоретическая часть
Физическая культура
Выпускная квалификационная
квалификационная работа
Краткая характеристика
государственное образовательное
Направление подготовки
Современное состояние
Практическое задание
Российская академия
Методическая разработка
История возникновения
теоретические основы
Самостоятельная работа
образовательное бюджетное
Название дисциплины
бюджетное учреждение
Финансовое планирование
история возникновения
Организация производства
Конституционное право
Правовое регулирование
Теория государства
Общая часть
Учебное пособие
Гражданское право
истории развития
Политические партии
Технология производства
концепции личности
основная часть
Организация работы
прохождении учебной
Антикризисное управление